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檢驗專業(yè)考試臨床檢驗基礎(chǔ)備考知識
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細胞因子檢測概述
一、生物學(xué)檢測法
生物學(xué)檢測又稱生物活性檢測，是根據(jù)細胞因子特定的生物活性而設(shè)計的檢測法。由于各種細胞因子具有不同的活性，例如IL-2促進淋巴細胞增殖，TNF殺傷腫瘤細胞，CSF刺激造血細胞集落形成，IFN保護細胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細胞因子獨特的生物活性，即可對其進行檢測。生物活性檢測法又可分為以下幾類：
1.細胞增殖法許多細胞因子具有細胞生長因子活性，特別是白細胞介素，如IL-2刺激T細胞生長、IL-3刺激肥大細胞生長、IL-6刺激漿細胞生長等。利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對特定細胞因子起反應(yīng)的細胞，并建立了只依賴于某種因子的細胞系，即依賴細胞株(簡稱依賴株)。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株CTLL-2在不含IL-2的培養(yǎng)基中很快死亡，而加入IL-2后則可右體外長期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細胞增殖與IL-2量呈正比，因此通過測定細胞增殖情況(如使用3H-TdR摻入法、MTT法等)鑒定IL-2的含量。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細胞，如胸腺細胞、骨髓細胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細胞等，均可作為靶細胞來測定某種細胞因子活性。
2.靶細胞殺傷法是根據(jù)某些細胞因子(如TNF)能在體外殺傷靶細胞而設(shè)計的檢測方法。通常靶細胞多選擇體外長期傳代的腫瘤細胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細胞的殺傷率。
3.細胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法某些細胞因子可刺激特定細胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2、IL-3誘導(dǎo)骨髓細胞合成胺、IL-6誘導(dǎo)肝細胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通過測定所誘生的相應(yīng)產(chǎn)物，可反映細胞因子的活性。
4.細胞病變抑制法病毒可造成靶細胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導(dǎo)致的細胞病變，因此可利用細胞病變抑制法檢測這類因子。
二、免疫學(xué)檢測法
細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性。隨著重組細胞因子的出現(xiàn)，可較方便地獲得細胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應(yīng)的特性，用免疫學(xué)技術(shù)定量檢測細胞因子。盡管細胞因子種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體(包括多克隆抗體或單克隆抗體)均可采用相似的技術(shù)開展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見細胞因子的檢測試劑盒均有商品供應(yīng)。此外還可利用酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗細胞因子單克隆抗體，原位檢測因子在細胞內(nèi)的合成及分布情況。免疫學(xué)檢測法可直接測定樣品中特定細胞因子的含量(用ng/ml表示)，為大規(guī)模檢測臨床病人血清中細胞因子的含量提供了方便。本法僅測定細胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行，因此要了解細胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，必須結(jié)合生物學(xué)檢測法。
三、分子生物學(xué)方法
這是一類利用細胞因子的基因探針檢測特定細胞因子基因表達的技術(shù)。目前所有公認的細胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細胞因子mRNA表達的方法多種多樣，常使用斑點雜交、Northernblot、逆轉(zhuǎn)錄PCR，細胞或組織原位雜交等。實驗的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測物(提取的mRNA樣品或細胞/組織標(biāo)本)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物(如生物素、地高辛等)標(biāo)記并與目的基因互補的DNA分子片段或單鏈DNA、RNA.根據(jù)其來源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點雜交及Northernblot，而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。核酸探針技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)程序化，以cDNA探針為例主要包括：①質(zhì)粒DNA的提取;②靶DNA分子片段的分離;③靶DNA分子片段標(biāo)記;④待測樣品mRNA的提取;⑤標(biāo)記cDNA探針對待檢樣品的雜交;⑥放射自顯影或顯色分析。近年來出現(xiàn)的RT-PCR檢測特異性mRNA的方法也廣泛用于細胞因子研究領(lǐng)域。該法具有靈敏、快速等優(yōu)點，甚至從1～10個細胞中就可檢出其中的特異mRNA。
巨噬細胞功能的檢測
正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒，據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。
(二)吞噬功能的檢測
巨噬細胞具有較強的吞噬功能，實驗室常用比細菌大的細胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細胞。其檢測原理是將受檢細胞與適量的顆�？乖旌虾螅�37℃保溫0.5～1h，其間時加振搖，最后離心取測定細胞制成涂片，染色鏡檢，分別計數(shù)出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。各實驗室應(yīng)根據(jù)自己的條件建立正常參考值。
(三)巨噬細胞溶酶體酶的測定
巨噬細胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶、溶菌酶等，測定這些酶的活性也是衡量巨噬細胞功能的實用指標(biāo)之一。
1.酸磷酸酶的測定
(1)硝酸鉛法：本法優(yōu)點是用普通試劑，價格便宜，一般實驗室均有條件做，封片后可較長時間保存，并可用電子顯微鏡研究觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。缺點是細胞必需固定，而且固定條件要求嚴(yán)格，如處理不當(dāng)酶活性易消失，反應(yīng)步驟也較多。
該法基本原理是在適當(dāng)?shù)拿感詶l件下，巨噬細胞內(nèi)的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸鈉水解成磷酸鹽后，后者與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛，而磷酸鉛再與硫酸銨反應(yīng)則形成黑色硫化鉛，沉積在胞漿內(nèi)酸所在處，顯示棕黑色顆粒。酶活性強弱可根據(jù)顆粒的數(shù)量和粗細不同而分級判斷，顆粒數(shù)量少則細的為+，顆粒多而粗的為++，顆粒很多且很粗的為+++。
(2)偶氮法：本法操作簡便，反應(yīng)液中的底物α-萘磷酸鈉被酸性磷酸酶分解后，形成萘酚和磷酸鹽，而萘酚結(jié)構(gòu)中的羥基(-OH)鄰近的活潑碳原子，立即與偶氮染料起反應(yīng)，而產(chǎn)生鮮艷的棕色沉積在酶所在處，缺點是封片后保存時間短。
2.非特異性酶的測定該酶比較穩(wěn)定，酶活性喪失較慢，細胞經(jīng)涂片干燥，置室溫至少可保存半天至一天，因此特別有利于臨床檢驗室采用。
常用α-萘醋酸法，該酶可將-萘醋酸分解成萘酚和醋酸，萘酚迅速與偶染料結(jié)合，形成有色反應(yīng)物而沉積。
(四)巨噬細胞促凝血活性測定
激活巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaC12混合液，加入經(jīng)粘附單層巨噬細胞的試管中，移置37℃，即時記錄血漿凝固時間。實驗證明當(dāng)巨噬細胞與LPS、腫瘤相關(guān)抗原或HbsAg等溫育后，可見血漿凝固時間明顯縮短。本法穩(wěn)定方便，也是檢測不同疾病患者巨噬細胞功能的指標(biāo)之一。
(五)巨噬細胞表面受體的檢測
成熟的巨噬細胞表面具有Fc受體和C3b受體，這些受體能識別經(jīng)IgG和C3b調(diào)理的顆粒，并迅速與之結(jié)合，促使細胞對相應(yīng)顆粒的吞噬，為此檢測這些受體可間接判斷巨噬細胞的功能。常用抗羊紅細胞致敏的羊紅細胞懸液作指示物進行EA花環(huán)試驗，也可用抗原(E)抗體(A)補體(C)復(fù)合物作EAC花環(huán)試驗。由于操作繁鎖，現(xiàn)僅供研究用。
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